為何要檢測內毒素 圖片

為內毒素無處不在

內毒素又稱為脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，分子量范圍為3,000至4,000Da，由長鏈復合多糖尾部和疏水脂質基團組成（圖1）），是大多數格蘭氏陰性菌細胞壁的組成部分，具有較高的熱穩定性。當細菌在活躍生長或在死亡分解時，細胞壁中的脂多糖就被釋放到周圍環境中。

圖1.脂多糖結構。內毒素為復合脂多糖，是革蘭氏陰性細菌細胞壁的活性結構成分。它們由核心寡糖鏈、O-特異性多糖側鏈（O-抗原）和脂質組分（脂質A）組成。

使用如大腸桿菌(E.coli)生產的重組蛋白，或者提取革蘭氏陰性菌內的核酸時經常遇到內毒素污染問題。內毒素污染的蛋白質/抗體/核酸在轉染入細胞中或者注入到動物體內時，可引發強烈的免疫反應，導致全身性炎癥反應綜合征（SIRS）和/或敗血癥。因此，內毒素的去除對于人類疾病治療的注射型藥品、生物制品等都是必須的，尤其對于基因藥物、蛋白藥物、抗體藥物、疫苗等生物制品的下游純化處理來說就顯得非常重要。

中國藥典的規定

細菌內毒素檢查法（通則 1143）包括兩種方法：凝膠法和光度測定法，后者又包括濁度法和顯色法，可以選用其中任何一種方法進行細菌內毒素檢查。凝膠法和光度法各具優點和局限：

凝膠法

凝膠法的優點是操作簡便，供試品在排除干擾作用后均可使用凝膠法進行檢驗。

凝膠法的干擾試驗是確定供試品能否使用凝膠法的決定因素。進行干擾實驗時，應挑選與鱟試劑反應呈陰性的樣品進行干擾試驗。若樣品稀釋到 MVD(有效稀釋倍數) 仍不能排除干擾作用，應進一步對供試品的前處理進行研究，再用干擾試驗驗證能否使用凝膠法。

光度法

光度法（包括濁度法和顯色法）可定量檢測內毒素的含量，能較為準確評估產品在生產過程中污染的相對風險，定量檢測的數據不僅有利于追蹤產品質量趨勢，還能起到風險預警的作用，更易達到數據完整性的要求。

由于光度法的檢測限范圍比凝膠法寬，使得有干擾的樣品可以有更大的稀釋倍數，對于部分使用凝膠法無法排除干擾的樣品，可以嘗試使用光度法建立細菌內毒素檢測方法。

常用實驗方法和干擾分析

鱟試劑是從海洋動物鱟提取的血細胞溶解物,是檢測革蘭氏陰性細菌內毒素的一種敏感試劑。其實驗原理如圖2所示：

圖2.鱟試劑的級聯反應。LPS（內毒素）激活質膜結合因子C。活化的因子C激活因子B，活化的因子B激活凝固酶原，生成凝血酶。加入顯色底物Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA后，活化的蛋白酶-凝血酶催化對硝基苯胺（pNA）的釋放，產生黃色。通過測量405nm處吸光度值進行定量。根據標準曲線可推算得出結果。紅色表示無活性酶，綠色表示活性酶。

通常實驗流程：

Thermo提供光度法內毒素定量試劑 (A39552）。那么試劑的品質如何？我們將從靈敏度、數據重復性、抗干擾性等幾個角度對Pierce內毒素定量試劑盒的性能進行驗證：

數據靈敏度和重復性

提供兩個線性動態范圍：0.01-0.1 EU/mL和0.1-1.0 EU/mL（圖3）。使用此試劑盒的實驗-實驗和操作者-操作者差異系數（CV）為3%。靈敏度高可以有效地避免內毒素定量中潛在的假陰性或者假陽性。

圖3.Pierce內毒素定量試劑盒的標準曲線。標準曲線顯示出優異的線性度，r2= 0.99。Pierce顯色法內毒素定量試劑盒的較低標準曲線范圍為0.01-0.1 EU/mL。0.1–1.0 EU/mL標準曲線表示使用內毒素標準品和阿米巴樣細胞裂解物培養14分鐘，隨后使用顯色底物培養6分鐘。對于較低濃度，使用內毒素標準品和阿米巴樣細胞裂解物培養30分鐘，隨后使用顯色底物培養6分鐘。低濃度標準品（0.01-0.1 EU/mL）顯示出了一致性和再現性（n = 17；CV = 3%）。

兼容性

鱟試劑可能受許多因素影響，造成假陰性或假陽性。包括：

i. 反應溫度、樣品酸堿度、離子強度和金屬離子（如鎂和鈣）

ii. 血清蛋白、核酸、脂肪酸、表面活性劑和螯合劑（如EDTA和肝素）可引起內毒素分子結構的變化

iii. (1-3)-β-D-葡聚糖的非特異性干擾：鱟試劑會與其反應，造成假陽性結果

表1.使用Pierce顯色法內毒素定量試劑盒，獲得有效內毒素檢測結果所兼容的高濃度。所列出的濃度是指樣品中添加0.5 EU內毒素時，未使定量值降低的實際濃度。以比例的形式表示稀釋濃度，其中1:100表示100倍稀釋

需要指出的是：Pierce顯色法內毒素定量試劑盒（貨號A39552）與β-葡聚糖兼容，并且在含有10ng/ mL（1,3）-β-D-葡聚糖的樣品中，未顯示出增強作用。

內毒素去除

超濾、多粘菌素B親和樹脂以及基于樹脂或膜的色譜法是內毒素去除的傳統方法，這些方法在蛋白回收率、內毒素結合能力等方面具有局限性，有的甚至本身具有毒。

Thermo Fisher Scientific提供高載量內毒素去除樹脂(88270)，是基于ε-聚賴氨酸親和樹脂（天然賴氨酸的聚合物），顯示出內毒素結合能力和蛋白質回收率：

? 結合力可以達到2,000,000 EU/mL

? 在處理初始內毒素水平為10,000 EU/mL的樣品時，去除效率可以達到99%以上

圖4.采用Pierce高通量內毒素去除樹脂去除內毒素的效率。（A）內毒素去除和定量的工作流程。（B）測定和去除蛋白質樣品中的內毒素以備下游應用。