不管是在藥物研發還是基礎科研中，檢測蛋白與小分子的相互作用都是一類重要的實驗。小分子最主要的特點是分子量較小，一般在1000 Da以下；并且結構性質各異，部分溶解度較差，需要使用有機溶劑（例如DMSO等）促溶；這些特點給相互作用的檢測帶來很大的挑戰。基于SPR（表面等離子體共振）原理的Biacore系統具有靈敏度高、可進行溶劑校正等優勢，不僅可以檢測較低的信號，且對分子量差異懸殊的互作類型也能精確檢測，同時還能消除有機溶劑帶來的影響，因此越來越多的研究者選擇Biacore進行蛋白與小分子相互作用檢測。

我們將根據智薈專線收集到的客戶反饋，針對Biacore系統檢測蛋白與小分子相互作用實驗中常出現的代表性問題，分上下兩篇進行簡單的分享與討論。本篇為上篇，將主要圍繞實驗設計和樣品準備方面的問題展開介紹。

一、配體的固定策略以及芯片的選擇

對于配體（固定相）采用合理的固定方式并達到所需的固定量，是Biacore實驗邁向成功的第一步。然而所有基于傳感器表面的檢測技術，都會面臨“物質遷移效應”的影響，所以根據實驗類型及科學的偶聯量計算公式去控制偶聯量非常關鍵。為此，目前僅有Biacore具備這樣嚴謹的計算公式，這其中固定量的計算方式主要就是參考以下核心方程式，并且其不僅適用于直接偶聯法的偶聯量計算，也可用于捕獲法的捕獲量計算：

公式中，RL為配體的固定量，Rmax為芯片表面的最大結合容量，Sm為化學計量比（未知情況時可先設為1）。此公式可以簡單理解為，Biacore中產生的響應值信號反映的是芯片表面質量的變化。一般情況下，對于動力學分析，要求Rmax ≤ 50 RU；對于親和力分析，要求Rmax ≤ 100 RU。由此計算得到理論固定量RL，在偶聯法中實際固定量可能需要1.5~3RL；在捕獲法中，則可以按照理論固定量來設定配體的捕獲量，因為捕獲過程的分子朝向固定，條件一般也是溫和的接近中性，最大程度地保留的配體分子的活性。

對于上面的核心方程式有了基本的了解之后，就可以回答下面這些問題了。

1是選擇固定蛋白還是固定小分子？

首先需要明確的是，如果您的實驗目的是想獲得精確的親和力數值，那建議選擇固定蛋白。考慮到小分子的固定難度、空間位阻以及固定過程對于結合的影響等方面的問題，選擇氨基偶聯的方式固定蛋白往往是最簡單、有效的固定方式。而小分子本身的活性基團有限，基團的反應活性也與蛋白存在一定的差異，偶聯條件需要摸索，另外，通過這些基團的偶聯反應可能也破壞了小分子僅有的結合反應活性位點。因此，只有對于某些特定類型的定性實驗，比如分子垂釣，固定小分子也是可行的，通常推薦的固定方式是使用SA芯片固定生物素修飾后的小分子，可以在比較明確的條件下實現穩定的固定，而且生物素分子在一定程度上可以起到間隔臂（spacer arm）的作用，減少小分子結合受到的空間位阻影響。

綜上所述，固定蛋白的過程相對簡單也適用于大多數結合反應，因此是目前探究蛋白與小分子互作時最常用的選擇。

2固定蛋白是選擇直接偶聯還是捕獲法？

先說結論：我們建議，進行蛋白與小分子互作實驗時優先考慮直接偶聯蛋白的方式。

直接偶聯（氨基偶聯）法的操作方法較簡便、明確，而且可以實現較高的偶聯量，在小分子作為分析物時，有利于獲得比較理想的響應值。例如常用的CM5芯片，最高偶聯量可以到10000 – 15000 RU，非常適合蛋白與小分子此類分子量差異懸殊的檢測。除了直接偶聯法以外，根據樣品性質與分子量差異，捕獲法也是一種您可以選擇的固定策略，例如：待固定的樣品未經純化，含有其他雜質；或者擔心直接偶聯的過程會影響結合位點等。在這些情況下，可以考慮通過捕獲法固定配體。當配體樣品的純度不夠時，捕獲的過程相當于在芯片表面進行了一次在線純化；捕獲過程的條件較為溫和，可以盡可能地保留配體的結合活性，同時保證配體自由朝向，充分暴露結合位點。

常用的捕獲類芯片以NTA芯片為例，這是一種可以通過螯合鎳離子捕獲帶有His標簽蛋白的捕獲芯片。如下圖1所示，NTA芯片上捕獲量大約在3000 – 4000 RU[1]最為穩定，非常適合His標簽蛋白與小分子二者分子量差異不是特別大的親和力檢測。

1. 在NTA芯片上，不同捕獲量水平下基線的穩定情況[1]。

3氨基偶聯蛋白配體是選擇CM5芯片還是CM7芯片？

CM5與CM7芯片表面均為羧甲基化修飾的葡聚糖基質，兩者最主要的區別是CM7芯片的羧基含量顯著高于CM5芯片，因此可以實現更高的偶聯量。圖2比較了三對蛋白與小分子的互作在CM5和CM7芯片上的結果差異，可以看到同一組互作實驗，在CM7芯片上可以達到的偶聯量和分析物響應值為CM5芯片的3倍以上 [2] 。

2. 三組蛋白與小分子互作在CM5和CM7芯片上的偶聯量與分析物響應值比較[2]。

如上所述，CM5芯片的最高偶聯量在10000 – 15000 RU左右，如果按照固定量計算公式得到的理論偶聯量遠超這個范圍，則可以考慮使用CM7芯片。簡單來說，當蛋白與小分子的分子量比值大于100時，就建議考慮換用CM7芯片。

二、樣品準備的相關問題

在確定了配體的固定策略，并選定了相應的芯片之后，就可以開始下一步的實驗了。進入試劑、樣品的準備階段，又會遇到哪些問題呢？我們接著往下看。

如何選擇運行緩沖液？

目前Cytiva供應的用于Biacore實驗的運行緩沖液主要有兩大類，分別是基于HEPES緩沖體系的HBS系列緩沖液與基于磷酸鹽緩沖體系的PBS系列緩沖液。

在選擇運行緩沖液時，并沒有明確的規定必須使用何種緩沖液，應該根據分子互作的自身性質選擇合適的緩沖液。一般來說，有以下經驗可供參考：當分析物是小分子的情況下可以首先嘗試PBS 或者PBS-P+緩沖液；而分析物為蛋白時可以首先嘗試HBS或者HBS-EP+緩沖液。

在一些情況下，小分子的溶解需要一定濃度的有機溶劑助溶，例如5% DMSO等，而這些有機溶劑在不同樣品之間的濃度差異會干擾響應值信號，因此需要對這部分由運行緩沖液造成的信號進行校正——溶劑校正。而有機溶劑自動校正的功能，也是Biacore的絕活兒之一，充分保證了最終實驗結果真實可信。關于溶劑校正的相關問題將在下篇中進行討論。

需要準備多少的蛋白用來偶聯？

實驗準備的配體蛋白量，至少要足夠其達到所需的偶聯量。下表展示了要達到不同的偶聯水平時所需的配體濃度以及相應的配體偶聯時間（流速為10 μL/min），可供參考[3]。需要注意的是，表中列出的“配體工作濃度”是用偶聯緩沖液醋酸鈉稀釋配體蛋白樣品后的濃度。為了讓稀釋后的蛋白樣品能夠充分富集在芯片表面，醋酸鈉的稀釋倍數一般要在20倍以上；如果稀釋倍數不夠，將影響配體蛋白偶聯效率。因此，準備配體蛋白母液時最好在工作濃度的20倍以上。

表1. 偶聯量與配體工作濃度參考表[3]。

對于一個未知的實驗，摸索合適的偶聯量等過程是必不可少的，因此對于蛋白配體的用量也不應僅限于夠一次偶聯實驗使用。一般的建議是，配體蛋白的準備量在1 mg/mL濃度、50 μL以上。但即便如此，老師們也能清晰的算出來Biacore對于蛋白的用量非常低，遠遠優于您其他的互作檢測手段。

小分子分析物的濃度范圍如何確定？

不管在動力學（Kinetics）分析還是在親和力（Affinity）分析中，分析物濃度范圍的確定均與結合反應的解離平衡常數（KD）有關。一般設置的分析物濃度梯度范圍如果能夠覆蓋KD值，將會達到較準確的擬合結果。在動力學分析中，一個理想的分析物濃度范圍可以從10 × KD作為最高濃度進行梯度稀釋；在親和力分析中，理想的分析物濃度范圍可以選擇從2 × KD的濃度作為最高濃度進行梯度稀釋[4]。對于蛋白與小分子的互作，大多數情況下是“快結合快解離”的模式，適用于親和力分析的模型（關于數據分析中模型選擇的問題，將會在下篇中進行討論）。蛋白與小分子結合反應的KD值，基本都在μM級別，因此可以將小分子最高濃度設為1000 μM，按照3倍甚至5倍的稀釋比例來配制濃度梯度（拉大范圍）。進行這樣的初步實驗后，基本可以確定反應KD值的大致范圍，后續可以調整濃度范圍、減小稀釋比例再進行進一步實驗。當然，小分子能夠達到的最高濃度還受到溶解度等因素的影響。

以上是針對Biacore檢測蛋白與小分子互作的實驗方案設計以及樣品準備方面的常見問題分享。良好的開端是成功的一半，合理的活性配體偶聯量、分析物濃度范圍以及運行緩沖液選擇，將幫助我們得到更理想的實驗結果。在下篇中我們將繼續分享關于實驗進行以及數據分析方面的常見問題，敬請期待！

文章來源：https://mp.weixin.qq.com/s/sG_kZkA5Kcdory0KPagPgw